收到細(xì)胞后,首先觀察瓶身是否完好(注意有無縫隙,裂痕);顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀況,有無細(xì)胞漂??;用新潔爾滅消毒瓶口及瓶身;打開瓶口,再次用新潔爾滅消毒瓶口(可能會(huì)有液體溢出,注意不要碰到液體),酒精燈烤瓶口消毒;將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至50ml離心管或廣口瓶中(若細(xì)胞漂浮嚴(yán)重,離心培養(yǎng)基,1000g*5分鐘,將離心后的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至另一個(gè)大離心管中,留一點(diǎn)吹打細(xì)胞沉淀成懸液,回收細(xì)胞至原培養(yǎng)瓶),若漂浮不嚴(yán)重,亦離心一下;在原培養(yǎng)瓶中留一部分原裝培養(yǎng)液,再補(bǔ)加自己新配的培養(yǎng)基至適當(dāng)容積,例如4ml,讓細(xì)胞適應(yīng)一下環(huán)境。 當(dāng)細(xì)胞長到70-80%,凍存大部分,小部分傳代。
關(guān)鍵操作規(guī)范:
復(fù)蘇流程:
快速解凍:37℃水浴中搖晃凍存管,5-10分鐘內(nèi)完成,加入4-6mL培養(yǎng)基離心去除DMSO37。
初始接種:細(xì)胞懸液置于T25瓶或6cm皿,24小時(shí)內(nèi)貼壁伸展,48小時(shí)換液。
日常維護(hù):
換液頻率:每周2-3次,pH值穩(wěn)定在7.0-7.4。
污染防控:嚴(yán)格無菌操作,定期檢測支原體,使用雙抗預(yù)防細(xì)菌污染。
異常處理:
貼壁失敗:復(fù)蘇24小時(shí)未貼壁的細(xì)胞存活率下降30%-50%,需棄用。
消化成團(tuán):吹打力度需輕柔均勻,避免機(jī)械損傷。
注意事項(xiàng):
1)細(xì)胞漂浮:培養(yǎng)瓶不開封,瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養(yǎng)箱。次日觀察,如細(xì)胞大部分又貼回瓶底,表明細(xì)胞活力正常,剩余漂浮的細(xì)胞可以離心去掉,留10ml培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察,細(xì)胞生長至匯合度80%,進(jìn)行消化傳代;如細(xì)胞還是不貼壁,將細(xì)胞離心收集轉(zhuǎn)到新培養(yǎng)瓶,原培養(yǎng)瓶加部分培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),中間注意觀察,我們的技術(shù)人員會(huì)一直跟蹤指導(dǎo),直到問題解決。
2)對于生長緩慢的貼壁細(xì)胞:可采用適當(dāng)?shù)奶岣吲囵B(yǎng)基中血清濃度,或隔日換液的方法來保證細(xì)胞的狀態(tài)和生長速度。